Os episódios de ITRS foram avaliados por um médico na clínica, com base nas informações registradas nos diários de saúde, nos questionários sobre sintomas de ITRS e nas entrevistas realizadas duas e quatro semanas após o início do período de intervenção. O questionário abrangeu 12 sintomas: (1) febre, (2) calafrios, (3) dor de cabeça, (4) coriza, (5) congestão nasal, (6) espirros, (7) tosse, (8) dor de garganta, (9) catarro, (10) fadiga, (11) dor muscular e (12) dor articular. Sintomas adicionais foram avaliados por meio de perguntas sobre os três sintomas a seguir: (13) náusea, (14) dor de estômago e (15) coceira nos olhos. Foi utilizada uma escala numérica de cinco pontos para avaliar a presença ou ausência de sintomas: 1, ausência de sintomas/sintomas quase imperceptíveis; 2, sintomas leves; 3, sintomas moderados; 4, sintomas de gravidade leve a moderada; e 5, sintomas graves.
Com base nos resultados do questionário, foram calculadas as taxas de incidência (taxas de incidência por período e cumulativa), a gravidade e o número cumulativo de dias de incidência de ITRS. Os períodos utilizados na análise incluíram o período basal (antes – dias 14 a 0), todo o período de intervenção (período completo – dias 1 a 28), o primeiro período (1º período – dias 1 a 14) e o segundo período (2º período – dias 15 a 28) Para evitar múltiplas comparações na análise estatística, os itens do questionário referentes a cada sintoma de ITRS foram sumarizados e a ordem da análise estatística foi estabelecida. Aos itens do questionário referentes a cada sintoma de infecção do trato respiratório superior (ITRS) foi atribuído um nível de análise 4.
Os sintomas nasais incluíam ‘coriza’, ‘nariz entupido’ e ‘espirros’. Os sintomas de faringite incluíam ‘tosse’, ‘dor de garganta’ e ‘expectoração’. Os sintomas associados à febre incluíam ‘febre’, ‘calafrios’, ‘dor muscular’ e ‘dor articular’. Os sintomas de mal-estar incluíam ‘dor de cabeça’ e ‘fadiga’. A esses sintomas foi atribuído um nível de análise 3. Os sintomas de nasofaringe foram definidos como a combinação de sintomas nasais e faríngeos, e os sintomas sistêmicos foram definidos como a combinação de sintomas associados à febre e sintomas de mal-estar; a eles foi atribuído um nível de análise 2. Por fim, os sintomas de nasofaringe e os sintomas sistêmicos foram integrados em ‘sintomas de ITRS’ e classificados com o nível de análise 1.
Para as correções múltiplas, o nível de análise 1 foi avaliado em dois momentos para um item; o nível de análise 2, em dois momentos para dois itens; o nível de análise 3, em dois momentos para quatro itens; e o nível de análise 4, em dois momentos para 12 itens. A taxa de incidência foi calculada dividindo-se o número de dias com sintomas pelo número de dias de análise e, posteriormente, expressos em porcentagem. A taxa de incidência cumulativa foi determinada mediante a verificação do número de indivíduos com um ou mais sintomas durante o período do estudo para cada grupo e, em seguida, pela avaliação da tendência utilizando o teste log-rank baseado no método de Kaplan-Meier.
Para minimizar o impacto das diferenças na variância das pontuações de cada sintoma de ITRS nos itens de avaliação integrada, a ‘gravidade’ de cada item foi calculada dividindo-se o valor médio pelo desvio padrão (valor médio/desvio padrão), ou seja, o inverso do coeficiente de variação. Assim, a gravidade dos sintomas de infecção do trato respiratório superior (ITRS), sintomas nasofaríngeos, sintomas sistêmicos, sintomas nasais, sintomas de faringite, sintomas associados à febre e sintomas de mal-estar refere-se à soma das gravidades dos itens que compõem cada categoria. Por exemplo, a gravidade dos sintomas nasais refere-se à soma das gravidades de coriza, congestão nasal e espirros. No entanto, quando o desvio padrão era zero, utilizou-se o valor médio. O número cumulativo de dias de incidência de ITRS foi comparado entre os grupos utilizando o número cumulativo de dias de cada sintoma, com os sintomas classificados como ‘com sintomas’ ou ‘sem sintomas’.
Preparação de PBMCs
As amostras de sangue foram submetidas a um procedimento para o preparo de PBMCs. Aproximadamente 12mL de uma amostra de sangue foram misturados a um volume igual de solução salina (Otsuka Pharmaceutical, Tóquio, Japão) à temperatura ambiente (20°C–25°C). A mistura resultante (24mL) foi cuidadosamente depositada sobre 15mL de Lymphoprep (STEMCELL Technologies, AS, Oslo, Noruega) em um tubo de centrífuga de 50mL, para cada amostra. Após centrifugação a 800×g em temperatura ambiente, com desaceleração lenta, por 30 min, a camada intermediária foi coletada e considerada como constituída por PBMCs.
As células coletadas foram centrifugadas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS; Nacalai Tesque, Quioto, Japão) contendo 2% de soro fetal bovino (2% FBS/PBS) a 400×g por 10 min a 4°C, e o sobrenadante foi removido. O sedimento de PBMC foi ressuspenso em FBS/PBS a 2%, e as células foram contadas. Em seguida, as PBMCs foram ressuspensas em CELLBANKER® 1 plus (Nippon Zenyaku Kogyo, Fukushima, Japão) resfriado em gelo. A suspensão celular foi fracionada em tubos de criopreservação e congelada em um CoolCell (Corning Inc., Corning, NY, EUA) em um freezer a −80 °C. No dia seguinte, os tubos foram retirados do CoolCell e transferidos para a fase de vapor de um tanque de nitrogênio líquido até o momento de sua utilização.
