LcS no desempenho de indivíduos saudáveis

Hiroko Kikuchi-Hayakawa¹, Hiroshi Ishikawa¹, Kazunori Suda^1,2, Yusuke Gondo¹, Genki Hirasawa¹,
Hayato Nakamura¹, Mai Takada¹, Mitsuhisa Kawai¹ e Kazunori Matsuda¹

¹ Yakult Central Institute, 5-11 Izumi, Kunitachi-shi, Tokyo 186-8650, Japan

² Yakult Honsha European Research Center for Microbiology VOF, Ghent, Belgium 

A exposição ao estresse ­psicológico causa vários distúrbios físicos e mentais através do sistema nervoso e endócrino, como depressão, dores de estômago, dores de cabeça, perda de apetite, diarreia, fadiga e insônia. O estresse ocupacional e os distúrbios do sono estão associados ao presenteísmo que se refere às perdas de produtividade dos funcionários que trabalham com condições de saúde precárias. No Japão, os custos correspondentes à perda de produtividade devido ao presenteísmo representam 80% do total dos custos relacionados com a saúde das empresas e são superiores aos custos do absenteísmo. Um dos sintomas do estresse mental são os distúrbios do sono, que aumentam erros de tarefas cognitivas e o risco de acidentes. Isso ocorre porque os distúrbios do sono podem causar fadiga, sonolência, diminuição do estado de alerta e falta de motivação, afetando o desempenho diurno. Esses indicadores de humor são comumente avaliados por questionários autoaplicáveis. No entanto, indicadores do estado fisiológico, como o eletroencefalograma (EEG) e a variabilidade da frequência cardíaca (VFC), têm sido utilizados como medidas substitutas do desempenho diurno.

O EEG é uma técnica não invasiva para registrar a atividade elétrica do cérebro e reflete mudanças no estado mental e na função cognitiva. As bandas de frequência EEG beta (13-30 Hz), alfa (8-13 Hz), teta (4-8 Hz) e delta (0-4 Hz) são comumente usadas para estudar atividades cerebrais. A onda P300 é um componente de potenciais relacionados a eventos (ERP) eliciado pelo estímulo-alvo em uma tarefa excêntrica que ocorre em torno da região de latência de 300 ms, e é comumente usada para estimar o desempenho cognitivo. A análise da VFC fornece informações sobre o estado do sistema nervoso autônomo. Os componentes de alta frequência (HF) a 0,15-0,4 Hz refletem a atividade ­nervosa parassimpática, enquanto a proporção entre os componentes HF e de baixa frequência (LF) (0,04-0,15 Hz) refletem a atividade nervosa ­simpática.

O sistema digestivo é altamente regulado pelo cérebro e pelo estado de espírito, como ansiedade, depressão e medo, que afetam ­muito as suas funções. O cérebro e o intestino trocam informações em ambas as dire­ções através dos sistemas nervoso, ­endócrino e imunológico e são intima­men­­te influenciados um pelo outro, formando uma relação chamada eixo ­intestino-cérebro. Nos ­últimos anos, o conceito de eixo microbiota-intestino-cé­rebro tem ganhado atenção à medida que estudos sobre estresse e doenças mentais produziram um crescente corpo de evidências de que a microbiota intestinal está envolvida no eixo intestino-­cérebro. Além disso, espera-se que os probióticos – que contribuem para a saúde do hospedeiro, seja diretamente ou através da melhoria do ambiente intestinal – exerçam ­efeitos positivos através do eixo intestino-­cérebro.

A cepa Lacticaseibacillus paracasei Shirota (LcS; anteriormente ­Lactobacillus casei Shirota) é um probiótico amplamente utilizado, que foi selecionado da coleção microbiana do Dr. Minoru Shirota, fundador da Yakult Honsha Co., Ltd. O LcS tem uma longa história de uso seguro como ingrediente alimentar há mais de 80 anos, e a Food and Drug ­Administration dos Estados Unidos o credenciou como Geralmente Reconheci­do como Seguro (GRAS). Numerosos estudos clínicos têm evidenciado que o LcS tem funções como normalização do movimento intestinal, prevenção de infecções e imunomodulação. Também foi descoberto que o probiótico atua nos sistemas nervoso e endócrino.

Anteriormente, foi relatado que uma intervenção com LcS em estudantes de Medicina que se preparavam para um exame acadêmico preveniu o aparecimen­to de sintomas físicos e ­atenuou o aumento do cortisol salivar induzido pelo estresse. Além disso, foi eficaz na manutenção da qualidade do sono sob condições de estresse acadêmico, suprimindo o declínio do sono profundo e encurtando a latência do sono, conforme medido tanto por questionários subjetivos quanto por medidas de EEG do sono. Para explorar a possível eficácia do LcS na melhora do desempenho diurno foi conduzido um estudo duplo-cego, randomizado, cruzado e controlado por placebo em participantes saudáveis com queixas de sono. O humor subjetivo foi avaliado por meio de questionários de humor percebido e medimos indicadores fisiológicos via EEG e VFC.

Materiais e métodos

A bebida testada foi um leite fermen­ta­­do contendo pelo menos 1,0 x 10¹¹ unidades formadoras de colônias (UFC) de LcS (cepa nº: YIT 9029) por frasco (100mL). O conteúdo nutricional por frasco foi o seguinte: 1,5g de proteína, 0,1g de gordura, 14,1g de carboidratos e 63,0 kcal calorias. O probiótico foi obtido do Laboratório de Pesquisa de Coleção de Culturas do Instituto Central Yakult, Tóquio, Japão. Como não há evidências suficientes da eficácia de qualquer probiótico em desempenho diurno, foi decidido usar um placebo inerte (leite não fermentado), para avaliar a contri­buição do LcS e de seus metabólitos para quaisquer benefícios à saúde para o desfecho.  O conteúdo nutricional, cor, sabor e pH do leite placebo não fermentado foram ajustados para corresponder à bebida teste. O placebo foi produzido com os mesmos ingredientes da bebida teste, com exceção ao ácido lático que foi adicionado para corresponder à acidez, e um frasco plástico idêntico foi usado para armazenamento e fornecimento da bebida teste e do placebo. As bebidas foram entregues semanalmente a cada participante e armazenadas entre 0^oC e 10^oC.

Desenho do estudo e participantes

Este estudo duplo-cego, randomizado, cruzado e controlado por placebo foi conduzido na cidade de Kunitachi, Tóquio, de agosto a dezembro de 2021. O protocolo do estudo foi registrado no Registro de Ensaios Clínicos da UMIN (University Hospital Medical ­Information Network) (ID: UMIN000044852). O estudo compreendeu um período de pré-intervenção de três semanas, um primeiro período de intervenção de quatro semanas, um período de washout de quatro semanas e um segundo período de intervenção de quatro semanas. Homens e mulheres saudáveis que trabalham em escritório foram recrutados neste estudo. Como havia pouca informação disponível sobre o impacto dos probióticos no desempenho diurno, o presente estudo é visto como um estudo exploratório neste campo e nenhum cálculo formal do tamanho da amostra foi realizado. O tamanho total da amostra foi definido considerando a capacidade de manuseio do sistema EEG, que deveria ser usado apenas nos dias de semana durante um período especificado.

Existem vários relatos de que as habilidades cognitivas diminuem com a idade e a carência de sono. Também foi relatado que os tempos de reação do movimento/tarefa diminuem com a idade, em comparação com os 40 anos. Com base nessas observações, foram escolhidos como participantes trabalhadores de escritório entre 40 e 59 anos que tinham consciência da qualidade do sono prejudicada. Foram excluídos do estudo aqueles que se enquadrassem a qualquer um dos seguintes critérios: histórico de doenças relacionadas ao sono, uso de medicamentos ou alimentos saudáveis que pudessem influenciar o sono, hábito de fumar, alergia a leite ou soja, colocação de marca-passo cardíaco artificial, doenças de pele no rosto ou na cabeça, sintomas graves de olho seco e participação em outro ensaio clínico durante o período do estudo. Finalmente, cinco homens e sete mulheres foram recrutados e divididos em dois grupos. Um grupo foi tratado com placebo e LcS (nessa ordem), e o outro grupo foi tratado na ordem inversa. A rando­mização simples foi realizada atribuindo-se números aleatórios de uma tabela de números aleatórios aos grupos. Os códigos dos tratamentos foram atribuídos por pessoal não envolvido no estudo, e os participantes e aqueles que administravam o tratamento ou avaliavam os resultados não tinham conhecimento da alocação do tratamento.

Medição diurna de EEG e VFC

As medidas de EEG e VFC foram realizadas em sala blindada durante a última semana de cada período: no período pré-intervenção e nos períodos de intervenção I e II. Os participantes foram submetidos a medições em qualquer dia de terça a quinta-feira pela manhã (8h – 11h) e à tarde (15h – 18h). Cada medição exigiu cerca de uma hora, incluindo preparação e limpeza, e o dia e horário das medições de cada indivíduo foram combinados entre os períodos experimentais. Os participantes foram instruídos a não consumir álcool por pelo menos 24 horas antes da medição e bebidas com cafeína no dia da medição, e foi confirmada a adesão dos participantes às instruções antes da medição.

Os sinais de EEG foram registrados com eletrodos Ag/AgCl colocados no couro cabeludo nas posições Fz, Cz e Pz de acordo com o Sistema Internacional 10-20. Dois eletrodos colocados em ambas as orelhas foram considerados como referência para os eletrodos do couro cabeludo, e dois eletrodos na testa serviram como aterramento e referência do sistema. Para auxiliar na eliminação dos dados obtidos durante movimentos ou piscadas dos olhos, um eletrooculograma (EOG) foi registrado com um eletrodo colocado 2cm lateral ao canto lateral do olho esquerdo e 2cm acima da borda superior da órbita esquerda. Os eletrodos também foram fixados no braço esquerdo para monitorar o eletrocardiograma (ECG) para análise da VFC. O EEG e o ECG foram registrados utilizando um dispositivo de gravação de sinais biológicos Polymate® (Miyuki Giken Co., Ltd., Tóquio, Japão) com taxa de amostragem de 1.000 Hz; as impedâncias de todos os eletrodos foram mantidas abaixo de 10 kΩ.

Os participantes realizaram toda a tarefa sentados em uma poltrona, fixando o olhar em um ponto diretamente à sua frente, a uma distância de 0,5m. Durante um período de tarefa de cinco minutos, os participantes realizaram tarefas auditivas excêntricas com um paradigma de dois tons. Os procedimentos seguiram as diretrizes da Sociedade Japonesa de Neurofisiologia Clínica, e um tom alvo (2.000 Hz) e um tom padrão (1.000 Hz) foram emitidos aleatoriamente a cada 2,0s com duração de 100 para cada – 150 vezes no total –, com taxas de aparecimento de 20% e 80%, respectivamente, usando o Programa Sequenciador de Saída de Estímulos v. 2009-Jan. (NoruPro Light System, Inc., Toquio, Japão).

Análise de EEG e VFC

O software de análise matemática MATLAB R2018b (MathWorks, Inc., Natick, MA, EUA) foi usado para analisar ondas cerebrais espontâneas. A transformação de Fourier foi realizada para dados removidos usando um filtro passa-banda de 0,5-30 Hz, e a análise do espectro de potência foi realizada em cada banda de frequência (onda teta, 4-8 Hz; onda alfa, 8-13 Hz; onda beta, 13-30 Hz). O potencial relacionado a eventos (ERP) P300 foi obtido e analisado pelo método da média aritmética utilizando o software EP Travel Light software v. 2009-Feb. (NoruPro Light Systems Inc.).

Quando foram observados P300a e P300b foi selecionado P300b, e quando foram observados três ou mais picos foram considerados inconclusivos. Um programa de análise baseado no método MemCal usando o software RR Interval ­Analysis v. software v. 2009-Feb. (NoruPro Light Systems Inc.) foi usado para analisar a frequência cardíaca e a VFC. Os ­componentes LF em 0,04-0,15 Hz, refletindo a atividade nervosa simpática e parassimpática, e os componentes HF em 0,15-0,4 Hz, refletindo a atividade nervosa parassimpática, foram analisados. A razão dos parâmetros LF/HF foi calculada como um índice de atividade nervosa simpática.

Questionários

O humor diurno, incluindo sonolência percebida, fadiga física, motivação, atenção e otimismo, foi pesquisado ­usando uma escala visual analógica (VAS) variando de 0mm para desempenho diurno ‘gravemente desfavorável’ a 100mm para ‘extremamente favorável’. A sonolência também foi avaliada em uma escala Likert de nove pontos usando a Escala de Sonolência Karolinska. Os participantes preencheram os questionários em horários arbitrários pela manhã (8h – 11h) e à tarde (15h – 18h) todos os dias, por cinco dias da semana durante a última semana de cada período. As informações sobre hábitos de sono e níveis de estresse também foram obtidas por meio de autoavaliações retrospectivas do período anterior de um mês antes da intervenção, usando o Índice de Qualidade do Sono de Pittsburgh (PSQI) e a versão japonesa da Escala de Estresse Percebido (JPSS), respectivamente.

Análise estatística

O efeito de ordem e o efeito de tempo do teste cruzado foram calculados a partir da análise de variância de medidas repetidas no período pré-intervenção, período de intervenção I e período de intervenção II. As variáveis foram submetidas à avaliação da eficácia do tratamento caso não apresentassem efeitos significativos de ordem e tempo (p≥0,05). A comparação pareada entre os períodos de ingestão de placebo e LcS foi realizada utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon. O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar as proporções nos atributos dos participantes. Para avaliar as associações estatísticas entre variáveis, o coeficiente de correlação de postos de Spearman (ρ) foi calculado para diferenças nos dados entre os períodos placebo e LcS. O coeficiente de correlação de postos de Spearman (ρ) também foi calculado para os dados do período pré-intervenção. Devido ao caráter exploratório do estudo e à definição clara de um único parâmetro de desfecho primário, nenhuma correção para testes de multiplicidade foi aplicada. O nível de significância foi fixado em 0,05, sendo considerado significativo menos de 0,05. Os softwares de análise estatística EZR e R v. 4.2.0 (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria) foram utilizados para a análise.