Após degradação da amostra em solução aquosa de ácido trifluoroacético (TFA) 4 M a 100°C por 2h, a amostra foi submetida ao método de derivatização de 1-fenil-3-metil-5-pirazolona (PMP) conforme descrito por Honda e colaboradores usando talose (No. 1634; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como padrão interno. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada utilizando uma coluna Symmetry 300 (4,6 × 250mm) com eluição a 1,0 mL/min utilizando tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 6,0)/CH3CN (82/18) a 35°C, e os eluatos foram analisados utilizando um detector UV a 245 nm.
Análise de açúcar e álcool de açúcar
As frações de LCPS-1 derivadas da degradação controlada de Smith (açúcar/álcool de açúcar) foram posteriormente degradadas usando uma solução aquosa de TFA 4 M a 100°C por 2h e o produto foi analisado usando cromatografia gasosa através do método de derivatização de trimetilsilil. As condições para GC foram as seguintes: cromatógrafo gás-líquido (HP6890; Agilent, Santa Clara, CA, EUA) equipado com coluna capilar J&W SE-52 (0,25 mm × 25 m, df = 0,3 μm; Agilent) a uma taxa de fluxo de 0,7 mL/min (He). No momento da injeção da amostra, a temperatura da coluna foi mantida por 30 min a 150°C, e então a temperatura foi aumentada até 200°C a uma taxa de 10°C/min. As temperaturas do injetor e do detector de ionização de chama foram ajustadas em 250°C.
Linkage type determination of glycosides
As posições de ligação do açúcar foram determinadas através da análise dos acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs). A análise de metilação foi realizada de acordo com um método descrito anteriormente usando hidróxido de sódio em pó e iodeto de metila. A quantidade de PMAA obtida foi medida via GC (HP6890; Agilent) e GC-MS (JMS700v; JEOL, Akishima, Tóquio, Japão).
Medição LC/Q-TOF-MS
O espectro de massa do álcool de açúcar foi medido no modo de injeção em fluxo (FI) e no modo LC/MS usando LC/Q-TOF-MS (QSTAR Elite; Sciex, Framingham, MA, EUA) equipado com ionização por eletrospray. A FI foi realizada a 40°C usando HCOONH4 10 mM (pH 6,5)/CH3CN (1/1) a uma vazão de 0,3 mL/min. As condições de HPLC para LC/MS foram as seguintes: foi usada uma coluna Unison UK-Amino (3,0 × 250 mm, 3 μm; Imtakt, Shimogyo-ku, Kyoto, Japão), a temperatura da coluna foi mantida a 50°C e a eluição foi realizada a uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min usando HCOONH4 10 mM (pH 6,5)/CH3CN (75/25).
Espectroscopia de NMR
Os espectros de 1D 1H e 13C e 2D COSY, TOCSY, HSQC, HMBC e híbrido HSQC-TOCSY foram medidos em 99,8% D2O a 30°C ou 60°C usando espectrômetros de NMR (ECA com gradiente de campo magnético H5XFG3; JEOL e Espectrômetro NMR DD2 de 700 MHz com sonda fria aprimorada de ressonância tripla 13C, VT700NB). 3 Trimetilsililpropanato-2,2,2,3-d4 (δH0,δC-1.6) foi usado como material de referência. Os espectros foram processados utilizando os softwares padrão Delta 5.05, JEOL e VnmrJ 4.2 (Agilent), respectivamente, equipados com cada máquina.
LCPS-1 ou o oligossacarídeo derivado da degradação de LCPS-1 foi dissolvido em D2O e colocado em um tubo NMR de 5 mm ou em um microtubo simétrico (BMS-005 V; Sigemi Co. Ltd., Hachioji, Tóquio, Japão). Experimentos 2D TOCSY e híbrido HSQC-TOCSY foram realizados com tempos de mistura de 150 ms. O experimento HSQC foi otimizado para J = 160 Hz (para correlações
1H-13C diretamente ligadas), e o experimento HMBC foi otimizado para constantes de acoplamento de 4 ou 8 Hz (para correlações 1H-13C de longo alcance). Para o experimento HSQC, foi realizado o desacoplamento no lado de 13C NMR.
O experimento sem desacoplamento no lado da 13C NMR também foi realizado para obter informações sobre as ligações α- e β- das cadeias de açúcar. Outros parâmetros foram empregados de acordo com os valores recomendados pelo fabricante. O estudo ‘Structural determination of the cell wall polysaccharide LCPS-1 in Lacticaseibacillus paracasei strain Shirota YIT 9029’ ou ‘Determinação estrutural do polissacarídeo LCPS-1 da parede celular no Lacticaseibacillus paracasei Shirota YIT 9029’ foi publicado no Carbohydrate Research 521 (2022) 108670 – doi: 10.1016/j.carres.2022.108670. •
