Harumi Mizukoshi, Kazumasa Kimura, Haruo Ikemura, Yoko Mori, Masato Nagaoka
Yakult Central Institute for Microbiological Research, Kunitachi-shi, Tokyo, Japan
O Lacticaseibacillus paracasei Shirota YIT 9029 (LcS – anteriormente Lactobacillus casei Shirota YIT 9029) é uma bactéria do ácido lático descoberta pelo médico e pesquisador Minoru Shirota em 1930. As bebidas probióticas contendo LcS têm sido amplamente consumidas no Japão há mais de 80 anos e a cepa tem várias atividades fisiológicas, incluindo capacidades imunomoduladoras. O LcS melhora a função imunológica do hospedeiro e reduz o risco de doenças, incluindo doenças infecciosas e câncer. Para enfermidades causadas por respostas imunes anormais (alergias, doenças inflamatórias intestinais, doenças autoimunes), os polissacarídeos na parede celular do LcS suprimem reações inflamatórias excessivas. Utilizando células mononucleares da lâmina própria (LPMCs) e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), Matsumoto e colaboradores descobriram que, quando ligado a um complexo polissacarídeo peptidoglicano (PS-PG1), LCPS-1 – um polissacarídeo isolado da parede celular do LcS –, suprime fortemente a produção de interleucina 6 (IL-6), reduzindo assim o risco carcinogênico devido à inflamação crônica no intestino grosso.
Os polissacarídeos da parede celular estão distribuídos de forma desigual pela superfície celular nos lactobacilos e estão envolvidos em diversas funções fisiológicas. Os pesquisadores tentaram analisar a estrutura desses polissacarídeos e relatórios indicam que, mesmo dentro da mesma espécie (L. lactis, L. rhamnosus, L. helvético, L. casei e outros), os açúcares constituintes e suas propriedades de ligação, ramificação, substituição e outras propriedades podem variar. Portanto, existem diferenças significativas na estrutura dos polissacarídeos da parede celular, resultando em uma alta diversidade estrutural na composição dessa parede. Além disso, um estudo que utilizou microarranjos de lectinas para comparar cepas de Lactobacillus casei de diferentes fontes de isolamento descobriram que a cepa YIT 9029 se ligava apenas à CSL (lectina de ligação a Rha).
Ademais, uma variante sem o gene cps1C envolvido na síntese LCPS-1 (Δcps1C) no YIT9029, além da perda de LCPS-1, se liga a múltiplas lectinas além de CSL e, portanto, CSL se liga à LCPS-1 Rha. A parede celular do LcS são compostas por um peptidoglicano do tipo A4 e dois tipos de polissacarídeos neutros (LCPS-1 e LCPS-2). Destes, a estrutura do LCPS-2 foi determinada por Nagaoka e colaboradores. No entanto, LCPS-1 é uma molécula muito maior que LCPS-2, está presente em pequenas quantidades absolutas, difíceis de purificar, e possui uma estrutura complicada. Por essas razões, a sua estrutura ainda não foi determinada. Nossa hipótese é que a determinação da estrutura do LCPS-1 é importante para elucidar os mecanismos pelos quais afeta as respostas imunes do hospedeiro e, assim, objetivamos determinar sua estrutura primária.
A análise de LCPS-1 por cromatografia de exclusão de tamanho indicou que o polissacarídeo apresentou uma distribuição de peso molecular na faixa de 50-1500 kDa com uma média de 400-500 kDa. A análise dos espectros 1H NMR, 13C NMR e DOSY de LCPS-1 mostrou que era um polissacarídeo macromolecular e havia ~10 sinais cada para prótons anoméricos e carbonos, indicando que LCPS-1 pode ter uma estrutura repetitiva. Além disso, quatro sinais de metila foram observados no espectro 1H NMR: dois sinais de metila do grupo acetil (N-acetil e O-acetil) e dois sinais de metila derivados de Rha. A análise do açúcar constituinte mostrou que LCPS-1 é composto de Glc, Rha, Gal e GlcN (ou GlcNAc) presentes em quantidades de 1700, 960, 470 e 330 nmol/mg, respectivamente, resultando em uma razão molar de ~10:6:3:2.
A análise de metilação de LCPS-1 mostrou a prevalência de sete tipos de acetatos de alditol parcialmente metilados (1,5-di-O-acetil-6-desoxi-2, 3,4-tri-O-metilmanitol, 1,5-di-O-acetil-2,3,4,6-tetra-O-metilhexitol, 1,3,5-tri-O-acetil-6-desoxi-2,4-di-O-metilmanitol, 1,4,5-tri-O-acetil-2,3,6-tri-O-metilhexitol, 1,2,5,6-tetra-O-acetil-3,4-di-O-metilhexitol, 1,3,4,5,6-penta-O-acetil-2-O-metilhexitol, 1,3,4,5,6-penta-O-acetil-2-N-metilacetamido-2-desoxihexitol). Foi identificada a presença de Rha1→, hexose1→, →3Rha1→, →4hexose1→, →2,6hexsose1→, →3,4,6hexose1→ e →3,4,6GlcNAc1→. No entanto, foi difícil analisar diretamente a estrutura química do LCPS-1 porque a estrutura principal tem um peso molecular elevado e é presumivelmente complicada. Portanto, utilizamos decomposição limitada para obter fragmentos-chave de LCPS-1 com pequenos pesos moleculares utilizando diferentes condições conforme descrito abaixo. Esses fragmentos foram analisados posteriormente.