Estudos clínicos demonstraram que probióticos como lactobacilos e bifidobactérias podem ter efeitos benéficos na saúde gastrointestinal. A maioria dessas cepas produz grandes quantidades de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e reduz o pH do cólon inibindo, assim, a colonização e a invasão por bactérias patogênicas. Essas cepas também podem modificar a resposta imunológica do hospedeiro e melhorar a função da barreira intestinal, o que pode ser usado para prevenir ou tratar diarreia. Uma das cepas probióticas mais prevalentes é o Lacticaseibacillus paracasei Shirota (LcS; anteriormente conhecida como Lactobacillus casei Shirota). Estudos demonstraram que a ingestão regular de LcS pode promover o funcionamento intestinal, ajudar a prevenir o câncer de bexiga, modular a função imunológica, reduzir o estresse psicológico tanto melhorar as anormalidades metabólicas em indivíduos obesos pré-diabéticos quanto a qualidade do sono.
No entanto, os mecanismos moleculares por trás desses efeitos não estão claros. Uma das razões para essa falta de informação detalhada é que a abundância relativa de cepas probióticas exógenas no intestino é muito menor do que a das bactérias comensais. Isso dificulta a análise das atividades metabólicas dos probióticos (ou seja, análise da expressão gênica por sequenciamento de RNA), mesmo com sequenciamento de última geração de alto rendimento. Portanto, se faz necessário o uso de tecnologias para aumentar o isolamento do Lactobacillus casei Shirota de amostras que contêm uma diversidade grande de bactérias indígenas. A separação por esferas magnéticas é um método que tem sido utilizado para purificar DNA e RNA, assim como para isolar proteínas, vírus e bactérias.
Por exemplo, esferas imunomagnéticas contendo anticorpos específicos para os antígenos de superfície da bactéria-alvo têm sido utilizadas para isolar e detectar as bactérias patogênicas Escherichia coli O157 e Clostridium difficile em amostras de alimentos e fezes. Isso implica que a separação por esferas magnéticas pode ser útil para isolar melhor o LcS das fezes. Portanto, pode facilitar o estudo dos mecanismos subjacentes às diversas ações benéficas dessa cepa probiótica no trato intestinal. Neste estudo, foi estabelecido um método de separação imunomagnéticas (IMS) para isolar o LcS das fezes humanas de forma eficaz. Para avaliar a eficiência e a especificidade desta abordagem foi analisada a recuperabilidade do LcS de amostras fecais coletadas de seis adultos saudáveis que haviam consumido anteriormente um produto lácteo fermentado comercial contendo LcS.
Materiais e métodos
Para o experimento, foram recrutados participantes sem queixas gastrointestinais subjacentes como constipação, diarreia, dor abdominal e síndrome do intestino irritável, ou que não haviam tomado antibióticos ou medicamentos para o trato gastrointestinal por 30 dias antes do início. Assim, seis adultos saudáveis do sexo masculino (participantes A–F, idade média de 34,5± 5,0 anos) foram incluídos. Antes da inclusão, os participantes receberam uma explicação sobre o estudo e forneceram o consentimento por escrito para participar. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Clínica de Cuidados Paramédicos de Chiyoda (número de aprovação: YKH22C2). O período do estudo consistiu em uma fase de uma semana sem ingestão e uma fase de quatro dias com ingestão. Durante o período sem ingestão, os indivíduos foram solicitados a manter suas dietas habituais, mas a abster-se de consumir produtos lácteos fermentados.
Ao longo do período de ingestão, os indivíduos foram novamente solicitados a manter suas dietas habituais, mas com a adição da bebida teste uma vez por dia após o café da manhã. A bebida era um leite fermentado disponível comercialmente contendo 1011 unidades formadoras de colônias (UFC) de LcS por frasco (Yakult 1000, comercializado pela Yakult Honsha Co., Ltd., Tóquio, Japão). Considerando que os indivíduos podem ter consumido alimentos contendo LcS antes do início do estudo, um período de abstinência de uma semana foi implementado para garantir a eliminação do LcS dos intestinos.
Após o período sem ingestão, um período de ingestão de LcS de quatro dias foi estabelecido para detectar LcS nas fezes de forma confiável. As fezes foram coletadas duas vezes de cada indivíduo: no último dia do período sem ingestão (Dia 0) e no último dia do período de ingestão (Dia 4). As amostras fecais foram coletadas diretamente em um saco plástico esterilizado (por radiação gama) pelos próprios indivíduos e mantidas com bolsas de gelo em um recipiente refrigerado. As amostras fecais foram imediatamente transportadas para o laboratório, e o experimento de cultura subsequente foi conduzido em até três horas após a coleta.
Quantificação de LcS viável nas amostras fecais
A quantificação de LcS viável nas amostras fecais foi realizada por método de cultura em combinação com a reação em cadeia da polimerase (PCR) de colônias. As amostras fecais foram homogeneizadas em nove volumes de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tóquio, Japão). Uma diluição seriada de 10 vezes (10-1 a 10-6) das fezes homogeneizadas foi realizada com DPBS. Em seguida, cada diluição fecal foi espalhada em placas de ágar lactitol – seleção de Lactobacillus – vancomicina (LLV). As placas foram incubadas aerobicamente a 37°C por 72h. Oito colônias de LcSlike (circulares, brancas e em forma de domo), selecionadas aleatoriamente, foram submetidas à PCR usando um conjunto de primers específicos para LcS (pLcS-57 F, 5′-CTCAAAGCCGTGACGGTC-3′ e pLcS-597R, 5′-ACGTGGTGCTAATAATCCTAGTG-3′) para identificar LcS. Estimamos as contagens viáveis de LcS com base no número de colônias no meio LLV que foram consideradas positivas para PCR de colônias.
Quantificação do total de LcS em amostras fecais
O total de LcS das amostras fecais foi quantificado utilizando a técnica de anticorpo fluorescência direta. Trezentos microlitros de solução de 4% de paraformaldeído-DPBS foram adicionados a 100 μL de diluição nas 10 amostras fecais, misturada e armazenada a 4°C durante a noite. No dia seguinte, a mistura foi centrifugada a 20.400g por dois minutos. Após o descarte do sobrenadante, o pellet foi suspenso no DPBS. Esta lavagem foi repetida duas vezes e o pellet final foi suspenso em 100 μL de DPBS. A suspensão foi, então, espalhada sobre lâmina de vidro revestida de MAS (lâmina de carga positiva) (Matsunami Glass Ind., Ltd., Osaka, Japan) e deixada secar exposta ao ar. Algumas gotas de solução contendo 1% de albumina sérica bovina – DPBS (aproximadamente 10 μL) e 0,02% TRITON-X foram adicionados à lâmina, levada para incubação em temperatura ambiente (TA) por 30 minutos em caixa umedecida.
Então, foram adicionadas algumas gotas (cerca de 10 μL) de anticorpo monoclonal específico de LcS (anticorpo L8, 10μg/ml) e, em seguida, foi incubado novamente por 30 minutos em TA e em caixa umedecida. Após a incubação, a lâmina foi gentilmente lavada com DBPS e adicionada uma diluição de 200 partes de goat anti-mouse IgM de cadeia (10μg/ml; Alexa Fluor 568, Abcam plc, Cambridge, Reino Unido), seguida de incubação em TA por 30 minutos no escuro e em caixa umedecida. Após a incubação, a lâmina foi lavada com DPBS, seca exposta ao ar e montada utilizando VECTASHIELD com meio de montagem antidesbotamento (Vector Laboratories, Califórnia, EUA). Imagens fluorescentes foram obtidas utilizando bloqueio de filtro fluorescente Y5 de Leica DM600B no sistema de microscopia fluorescente (Leica Microsystems, Inc., Wetzlar, Germany), e foram contadas células positivas para anticorpo L8 nas imagens de fluorescência.
Marcação de biotina de anticorpo L8 e IMS
A marcação de biotina de anticorpo foi realizada com a Biotin Labeling Kit-NH2 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Maryland, EUA). O IMS foi realizado com o marcador de biotina de anticorpo L8 e marcado com estreptavidina Dynabeads (MyOne Streptavidin T1; Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, EUA). Primeiro, a amostra fecal foi diluída em 10 partes com DPBS e centrifugada a 80g por 10 minutos. Partículas foram removidas do sobrenadante por filtro de célula tamanho 35 μm (Becton, Dickinson and Company, Nova Jersey, EUA). Depois, 1ml do filtrado foi removido para um novo tubo, e 20 μL de marcador biotina marcadora de anticorpo L8 foi adicionado. O tubo foi agitado no minirrotador RT-30 (TAITEC, Co., Saitama, Japão) na velocidade de 10r/min por 1h, na temperatura de 4°C.
Após a agitação, 40 μL de esferas magnéticas marcadas com estreptavidina (2,8-4,8 x 108 esferas), que foram lavadas com DPBS previamente, foram colocadas no tubo que passou novamente por uma agitação suave no minirrotador RT-30 utilizando as configurações anteriores. Após a agitação, as esferas magnéticas foram aderidas à parede do tubo utilizando um imã (MojoSortTM Magnet, BioLegend, Inc., Califórnia, EUA) e o sobrenadante foi removido. Um mililitro de DPBS foi, então, adicionado ao tubo e as esferas foram suavemente misturadas por pipetação. Depois, as esferas magnéticas foram aderidas à parede do tubo utilizando um ímã e o sobrenadante foi removido. Após repetir esse procedimento três vezes, as esferas foram finalmente suspensas em 1 ml de DPBS.
Recuperação de LcS das fezes humanas após IMS
Para demonstrar a recuperação de LcS das fezes usando a IMS, 0,01g, 0,03g e 0,10g das amostras de fezes coletadas no dia 4 (após a ingestão de produto contendo LcS) foram diluídos em 10 partes com DPBS. Os fragmentos do LcS foram isolados de cada diluição fecal por IMS e suspendidos em 1ml de DPBS. Uma solução seriada de 10 partes de diluição (10-1 a 10-5) das esferas suspensas foi feita com DPBS e uma porção diluída de solução foi espalhada em meio de ágar LLV e incubada anaerobicamente em 37°C por 72h. Depois da incubação, colônias foram conduzidas por PCR para identificação e contagem do LcS.
Sequência metagenômica 16S
O DNA fecal foi extraído conforme reportado anteriormente por Nagara e colaboradores, e a composição bacteriana foi determinada utilizando o sistema MiSeq (Illumina, Inc) da seguinte forma. Primeiro, as regiões V1-V2 do gene 16S rRNA foram amplificadas utilizando 27Fmod2-MiSeq (5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT-CTAGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3′) e 338R-MiSeq 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNNNNNN-GTGACTGGAGTTCAGACG-TGTGCTCTTCCGATCTGCTGCCWCCCGTAGGWGT-3′) e SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio, Inc., Shiga, Japão). A amplificação foi performada com a aplicação de um sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems 7500 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) utilizando ciclos repetitivos a 95°C por 30s, 55°C a 30s e 72°C a 90s. O ciclo foi parado quando a amplificação atingiu o platô. O amplicon obtido foi analisado utilizando MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina, Inc., Califórnia, EUA). A sequência de dados foi analisada utilizando QIIME2; o plugin DADA2 via comando dada2-denoise-paired foi usado para remover ruído e aparar as sequências. As sequências do gene 16S rRNA bacteriano foram classificadas usando a função de classificação de recursos ‘classify-sklearn’ no banco de dados Greengenes (versão 13_8) (clusters de identidade de 99%). Foram observadas características em 5.000 leituras por amostras, que foram calculadas utilizando QIIME2″QIIME diversuty alpha-rarefaction”. Análise estatística foi realizada utilizando R ver. 4. 0. 2. O teste de soma de opostos de Wilcoxon foi utilizado na comparação de α-diversidade.
