Os pesquisadores concentraram na presença de resíduos GlcNAc em LCPS-1 e tentaram a desaminação para degradar especificamente a hexosamina. GlcNAc em LCPS-1 é substituído na posição 3; assim, primeiro foi realizado a desacetilação usando o método de Erbing e colaboradores e, posteriormente, a desaminação. A mistura de reação foi fracionada nos fragmentos chave Fr. 1, Fr. 2, e Fr. 3 com base no peso molecular, e os açúcares constituintes de cada fração foram analisados. Cada fração compreendia Glc, Gal, Rha e 2,5-anidromanitol (um produto de decomposição de GlcNAc). Foi ajustado o nível de 2,5 anidromanitol para 1 e calculamos a razão Glc:Gal:Rha para cada fração. Para o Fr. 3, a razão Glc:Gal:Rha foi de 3:1:2 e compreendia aproximadamente sete resíduos de açúcar. Da mesma forma, a proporção para Fr. 2 foi 7:2:4 e compreendia ~14 resíduos de açúcar; a proporção para Fr. 1 foi 27:7:14 e continha ~49 resíduos de açúcar. Além disso, foram comparados os espectros 1H RMN, 13C NMR e HSQC para Fr. 1, Fr. 2, e Fr. 3. Espectros semelhantes foram observados para Fr. 1 e Fr. 2, e as estruturas básicas foram consideradas altamente semelhantes. Fr. 3 teve o menor peso molecular e foi considerado uma estrutura parcial de Fr. 1 e Fr. 2.
Estrutura do Fr. 1
Fr. 1 mostrou um espectro 1H NMR semelhante ao Fr. 2. Contudo, na região anomérica, a proporção de αRha ligada ao 2,5-anidromanitol que constitui a cadeia linear foi de 1:1 em Fr. 2, enquanto 1:6 em Fr. 1. No Fr. 1, a proporção de Glc:Gal:Rha foi estimada em 27:7:14 quando 2,5-anidromanitol estimado como estando na extremidade redutora, foi definido como 1. Julgando pela proporção destes constituintes e pela proporção integral do espectro 1H NMR, a estrutura de Fr. 1 (X’×6 + S’) foi atribuída da seguinte forma: {6[Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]Glcβ1}6-6[Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]anidromanitol.
Estrutura do Fr. 2
A partir dos resultados da análise do açúcar constituinte foi inferido que o Fr. 2 compreendia 14 açúcares, porque a proporção de Glc:Gal:Rha em relação a um resíduo de 2,5-anidromanitol foi de 7:2:4. Comparando a análise 1H NMR do Fr. 3 e Fr. 2 foram observados seis sinais de prótons anoméricos para o Fr. 3; no entanto, para o Fr. 2, foi observado outros sete sinais adicionais. Ao comparar os espectros 1H NMR, 13C NMR e HSQC de Fr. 2 e Fr. 3, a estrutura do Fr. 2 foi estimada como tendo uma configuração (X’+S’) onde, além do 7-resíduo de Fr. 3 (referido como Y’), um segmento com anidromanitol substituído por Glc (referido como X’) na extremidade redutora de Fr. 3 estava vinculado a Gal na extremidade não redutora: [Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]Glcβ1-6[Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]anidromanitol.
Estrutura do Fr. 3
A partir da análise da composição do açúcar foi estimado que Fr. 3 contém aproximadamente 7 açúcares, isto é, 3 resíduos Glc, 1 resíduo Gal, 2 resíduos Rha e 1 resíduo GlcNAc. Anteriormente, a análise de espectroscopia de correlação total (TOCSY) e correlação heteronuclear de quantum único (HSQC)-TOCSY de polissacarídeos mostrou que é possível observar prótons do mesmo sistema de spin estabelecendo um longo tempo de mistura. Para análise HSQC-TOCSY de Fr.3, foi definido um longo tempo de mistura de 150 ms.
Posteriormente, os sinais de correlação da posição C1 (carbono anomérico) para a posição do carbono C6 foram avaliados para sinais de prótons anoméricos de 1H NMR números 1 (δ4,7), 2 (δ4,5) e 5 (δ5,0). Para Gal, a configuração molecular do grupo hidroxila na posição C4 é diferente daquela para Glc, e as constantes de acoplamento (JH4,H5) nas posições C4 e C5 foram inferiores a 1Hz. Como a correlação foi bloqueada na posição C4, foram obtidos apenas quatro sinais de correlação. Portanto, os números de prótons 1, 2 e 5 foram atribuídos aos prótons anoméricos de Glc e o número 6 foi atribuído a Gal.
Além disso, a configuração anomérica das ligações glicosídicas foi avaliada utilizando análise de correlação heteronuclear a múltiplas ligações (HMBC). Para o espectro 1H NMR, as constantes de acoplamento (JCH) do carbono/próton anomérico são geralmente observadas na faixa de 160-170 Hz, que é diferente das constantes de acoplamento em outras posições (menos de 145 Hz). Sabe-se que as ligações α-coordenadas têm um valor de ~170 Hz, e as ligações β-coordenadas têm um valor de 160 Hz; a diferença é de ~10 Hz. Os resultados resumem as constantes de atribuição e ligação para o sinal anomérico, a atribuição das posições C2-C6 por COSY e o sinal de correlação com o resíduo de açúcar adjacente obtido do HMBC. Estes resultados mostraram que βGlc (sinal nº 1) está ligado a αGal (nº 11) e às posições anoméricas dos três resíduos de açúcar βGlc (nº 2), αRha (nº 4) e αGlc (nº 5) que estão todos ligados e ramificam-se do 2,5-anidromanitol (No. 7), que é gerado pela decomposição do GlcNAc. Da mesma forma, βRha (No. 3) está ligado a βGlc (No. 2) e αGal (No. 6) está ligado a βRha (No. 3).
O modo de ligação do 2,5-anidromanitol foi analisado via análise de espectro HMBC. Dos grupos hidroximetileno (sinal No. 35 e 36), o No. 35 é presumivelmente C6 porque um pico de intersecção é observado com o αGlc adjacente (No. 5), resultando no No. 36 como C1. Análise do grupo metino revelaram picos cruzados entre os sinais No. 7 e No. 9, No. 8 e No.9 e 10, No. 9 e No. 7, e No. 10 e No. 8. Além disso, foram observados picos cruzados entre No. 7 e o βGlc adjacente (No. 2) e o No. 9 e o αRha adjacente (No.4). Com base nesses resultados, o No. 7 foi atribuído à posição C4, No. 8 a C2, No. 9 a C3, e No. 10 a C5. Entre os resíduos de açúcar que constituem o Fr. 3, a posição de ligação ao αGal restante indica que o carbono anomérico (sinal No. 6) e o grupo metino (No. 11) em αGal eram o mesmo resíduo de açúcar.
Foi avaliada a correlação entre o grupo metino (No. 11) e βGlc (No. 1) via HMBC e utilizando os resultados de degradação da metilação de Fr. 3, e descobriu que βGlc (No. 1) estava ligado à posição 2 de αGal (No. 6). Em resumo, a metilação de LCPS-1 rendeu 1,2,5,6-tetra-O-acetil3,4-di-O-metil galactitol (→2,6Gal1→), enquanto o Fr. 3 (desaminação) rendeu 1,2,5-tri-O-acetil-3,4,6-tri-o-metil galactitol (→2Gal1→) e Fr. S (degradação controlada de Smith) rendeu Rha-eritritol, GlcNAc-glicerol e Glc-glicerol. Depois de avaliar os dados, foi inferida a seguinte estrutura para o Fr. 3: Glcβ1-2Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]anidromanitol.
Estrutura inferida do LCPS-1
A estrutura primária do LCPS-1 foi avaliada a partir dos resultados obtidos. Rha1→2eritritol, GlcNAc1→1glicerol e Glc1→1glicerol foi obtido na proporção de 3:2:1 após degradação controlada de Smith. Depois de realizar múltiplas degradações de desaminação, embora rendimentos constantes para Fr. 1 e Fr. 3 tenham sido obtidos, o rendimento de Fr. 2 foi instável. Portanto, Fr. 2 pode ser um produto de decomposição que é ocasionalmente gerado por reações secundárias, e a estrutura repetitiva principal pode ser composta por Fr. 1 e Fr. 3. As proporções aproximadas de açúcares constituintes (Glc:Gal:Rha) dos produtos de desaminação (com 2,5-anidromanitol definido para 1) foram as seguintes: Fr. 3 (3:1:2); Fr. 2 (7:2:4) e Fr. 1 (27:7:14). Portanto, dado que o Fr. 1 é composto por 49 açúcares e X e Y têm sete açúcares como unidade básica, Fr. 1 é considerado como tendo sete unidades de açúcar (X6Y). Portanto, considerando que X e Y existem em uma proporção de 1:2, o LCPS-1 parece ter uma estrutura repetitiva de 6 unidades X com 12 unidades Y atrás dela (X6S12). Com a determinação da estrutura primária do LCPS-1, acredita-se que a elucidação da função imunomoduladora do LcS irá progredir no futuro.
O-desacetilação de LCPS-1
Como o sinal δ5.6 observado na região anomérica espectro 1H NMR de LCPS-1 correlacionado com um sinal próximo de δ70 no espectro 13C NMR, foi inferido que este sinal não corresponde a um próton anomérico. Quando LCPS-1 foi submetido à seleção O-desacetilação, o sinal δ5.6 e o sinal δ2.2 acetil metil estavam ausentes. A falta desse sinal foi confirmada por desaminação e fracionamento utilizando Bio-gel P2. Os picos de correlação foram analisados usando o HSQC-TOCSY e espectros COSY do LCPS-1. Como um pico cruzado foi formado entre o próton de δ5.6, o próton anomérico e o próton metila de βRha, foi inferido que o grupo O-acetil estava ligado a βRha. Além disso, foi observado um sinal de correlação entre o próton anomérico βRha e o sinal δ5.6 do espectro COSY, e concluído que o grupo O-acetil está ligado à posição 2 de βRha.
Acoplamento de GlcNAc e βGlc a αGal
O (→2,6Gal1→) identificado durante a análise de metilação de LCPS-1 tornou-se (→2Gal1→) via desaminação. Foi inferido que GlcNAc e βGlc estavam ligados à posição 6 de αGal, e a hipótese foi apoiada pelos resultados da degradação controlada de Smith de LCPS-1 e pelos vários espectros de NMR 1D e 2D de LCPS-1.
Estruturas básicas que compõem o LCPS-1
X’ e Y’, que constituem o Fr. 1, 2 e 3, são as unidades estruturais básicas do LCPS-1. Foi inferido que tanto X quanto Y consistem em sete açúcares nos quais um grupo O-acetil está ligado à posição 2 do βRha de cadeia linear a partir dos resultados da O-desacetilação de LCPS-1.
