Xiaodong Yang^a, Xiaoqin He^a, Shaoqing Xu^a, Yi Zhang^a, Chengjun Mo^a, Yiqiu Lai^a, Yanyan Song^b, Zheng Yan^c, Penghui Ai^a, Yiwei Qian^a e Qin Xiao^a
aDepartment of Neurology and Institute of Neurology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, P.R. China
^bDepartment of Biostatistics, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, PR China
^cShanghai Institute of Nutrition and Health, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, PR China 

A ­­­­­doença de Parkinson (DP) é uma enfermidade neurodegenerativa caracterizada por sintomas motores, incluindo bradicinesia, tremores de repouso e rigidez. No entanto, os sintomas não motores (SNM), como os neuropsiquiátricos, distúrbios do sono-­vigília e constipação, ganharam relevância nos últimos anos. Desses sintomas, a constipação está entre os SNM mais comuns da DP, com prevalência de 70%-80%. Muitas características não motoras estão intrinsecamente relacionadas entre si e podem sobrepor-se na sintomatologia e nos tratamentos. Os SNM ­podem desenvolver-se em qualquer fase da doença e afetar ­gravemente a qualidade de vida geral dos pacientes com DP, e opções efica­zes de gerenciamento foram reco­nhecidas como uma importante ­necessidade não atendida no ambiente clínico. No entanto, terapias limitadas estão disponíveis para déficits não moto­res. As intervenções ­padrão atuais, como a terapia de reposição de dopamina, são limitadas no tratamento de disfunções não motoras. De fato, alguns aspectos das disfunções não motoras podem até ser agravados pelo tratamento com ­dopamina.

Houve um aumento na cons­­cien­­­tiza­ção sobre a ­associação ­entre a microbiota intestinal e a DP. À medida que se acumulam evidências sobre os efeitos da microbiota intestinal no desenvolvimento e avanço da doença, outro direcionamento de ação tem sido reconhecido em relação ao uso potencial de estratégias terapêuticas baseadas na microbiota na DP. Consequentemente, as intervenções direcionadas à microbiota, incluindo a administração de probióticos, têm sido cada vez mais avaliadas. Estudos descobriram que a ingestão de leite fermentado, que contém fibras e múltiplas cepas de probióticos ou cápsulas contendo diversas cepas de probióticos (incluindo Bifidobacterium, Lactobacillus e outros) por quatro semanas, pode melhorar os sintomas associados à constipação em pacientes com DP. No entanto, um estudo relatou que o tratamento com probióticos pode aliviar a dor abdominal e o inchaço tanto quanto o tratamento com trimebutina, com menor melhora na constipação. ­Francamente, ainda existem muitas dúvidas sobre o uso adequado da terapia com probióticos para a DP.

Primeiro, em teoria, os efeitos terapêuticos de um único probiótico e seus efeitos sobre os sintomas gastrointestinais são mais simples de avaliar do que os suplementos com multicepas probióticas. Além disso, uma revisão recente não encontrou ­evidências convincentes de que os suplementos com multicepas probióticas fossem superiores aos suplementos com um único probiótico. Seria necessário realizar ensaios individuais para confirmar o efeito de um probiótico específico. Em segundo lugar, como a duração da intervenção em ambos os estudos foi de apenas quatro semanas, serão necessários mais estudos sobre a eficácia em longo prazo e o perfil de segurança da administração de probióticos na DP. Na verdade, Bifidobacterium e Lactobacillus estão incluídos na maioria das formulações probióticas, mas são dois dos gêneros que têm aumentado comumente em pacientes com DP. Em terceiro lugar, ainda falta uma análise abrangente do impacto da suplementação de probióticos nos sintomas motores e não motores. E como os probióticos contribuem para a homeostase ou a melhoria dos sintomas, assim como os mecanismos, permanecem sem esclarecimentos.

A cepa Lacticaseibacillus ­paracasei Shirota (L. paracasei YIT 9029; LcS), anteriormente classificada como ­Lactobacillus casei ­Shirota, tem sido utilizada na produção de leite fermentado há mais de 80 anos. Muitos estudos descobriram que o LcS proporciona muitos efeitos benéficos, incluindo proteção contra infecções, melhora na imunorregulação, redução do risco de carcinogênese e aumento da motilidade intestinal. Pela primeira vez, um estudo piloto mostrou melhorias na consistência das fezes e nos hábitos de defecação em pacientes com doença de Parkinson que usaram LcS como suplemento de cepa única.

Neste experimento foi projetado um estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo para investigar o efeito da suplementação de LcS nas respostas clínicas e na homeostase microbiana intestinal em pacientes com DP. O estudo foi realizado na Clínica de Distúrbios do Movimento do Departamento de Neuro­logia do Hospital Ruijin da Faculdade de Medicina da Universidade Shanghai Jiao Tong, na China. Os pacientes foram avaliados quanto à elegibi­lidade quando foram diagnosticados com DP de acordo com os critérios do Queen Square Brain Bank da doença de Parkinson, e foram avaliados quanto ao cumprimento dos critérios de Roma III para constipação funcional. Outros critérios de inclusão e exclusão estão descritos nos Métodos ESI.

Os pacientes elegíveis foram randomizados para receber leite fermentado (100ml, contendo 1×10¹⁰ células de LcS vivas) ou um placebo (fabricado pela ­Yakult Corp., Shanghai, China) uma vez ao dia no café da manhã, por 12 semanas. O placebo foi um leite acidificado sem LcS, com mesmo teor nutricional, cor, sabor e pH, elaborado com os mesmos ingredientes (sem o LcS), com adição de ácido láctico. O ensaio consistiu em um período inicial de duas semanas, uma ­intervenção de 12 semanas e duas visitas (V1 e V2). As bebidas foram distribuídas a cada participante a cada duas semanas, em pacote refrigerado e armazenadas entre 0°C e 10°C. O engajamento foi monitora­do por meio da devolução dos frascos pelos participantes. O estudo seguiu as diretrizes estabelecidas na Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Ruijin da Faculdade de Medicina da Universidade Shanghai Jiao Tong. Todos os participantes forneceram seu consentimento por escrito. O estudo foi registrado no Chinese Clinical Trial Registry: ChiCTR1800016795, e todos os experimentos foram realizados em conformidade com as leis e diretrizes nacionais da China.

Randomização

Os pacientes elegíveis foram randomizados para o braço probiótico ou placebo usando uma sequência de randomização gerada por computador, por um estatístico independente que não estava envolvido no gerenciamento de dados ou nas análises estatísticas. O tamanho dos blocos não foi divulgado aos investigadores. Os pacientes e investigadores desconheciam a alocação do tratamento. A abertura do cego para análises estatísticas foi realizada após bloqueio do banco de dados.

Avaliação clínica e coleta de amostras

As visitas foram realizadas para cada participante no final do período inicial e no final da intervenção. Foram registrados dados demográficos – idade, sexo e índice de massa corporal (IMC) –, uso de medicamentos antiparkinsonianos, idade de início e duração da doença. A gravidade da doença foi avaliada usando a Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson da Movement Disorder Society (MDS-UPDRS) e a escala Hoehn e Yahr (escala H&Y) durante a condição ‘ON’. Sintomas não ­motores, depressão, ansiedade e qualidade de vida foram avaliados usando a Escala de Sintomas Não Motores (NMSS), Escala de Depressão de Hamilton (HAMD-17), Escala de Ansiedade de Hamilton (HAMA) e Questionário de Doença de Parkinson de 39 itens (PDQ-39), respectivamente. A função cognitiva foi avaliada pelo Mini Exame do Estado Mental (MEEM) e Avaliação Cognitiva de Montreal (MoCA). A dosagem diária equivalente de levodopa (LEDD) foi calculada de acordo com estudo publicado anteriormente. A gravidade da constipação foi avaliada usando o Sistema de Pontuação de Wexner para Constipação. A qualidade de vida relacionada à constipação, incluindo desconforto físico, desconforto psicossocial, preocupações/preocupações e satisfação, foi medida por meio do questionário qualidade de vida relacionada à constipação (PAC-QOL).

Os participantes foram treinados para preencher o diário de fezes duas semanas antes do início do estudo e nas semanas 11 e 12 do período de intervenção – os números médios foram calculados incluindo o número de evacuações (BMs), a consistência das fezes e o uso de laxantes. A consistência das fezes foi avaliada pela Escala de Forma de Fezes de Bristol (BSFS: 1 = caroços duros; 2 = salsicha com grumos; 3 = salsicha quebrada; 4 = salsicha lisa; 5 = caroços moles; 6 = pastosa; 7 = aguada). Amostras de fezes e sangue foram coletadas de cada participante no final do período inicial e no fim da intervenção. As amostras fecais frescas foram coletadas pelos pacientes pela manhã usando recipientes estéreis para coleta de fezes, imediatamente transportadas em gelo para o hospital e, depois, armazenadas a -80°C antes do teste. As amostras de sangue foram coletadas em tubos ­contendo ácido etilenodiaminotetracético (1mg ml-1) e glutationa (1mg ml-1) e imediatamente centrifugadas (3.000 rpm por 10min a 4°C). O plasma foi extraído das amostras de sangue, transferido para um novo tubo de centrífuga e armazenado a -80°C antes do processamento.

Sequenciamento de 16S rRNA e medição da metabolômica

As regiões V3-V4 do gene 16S rRNA foram amplificadas e sequenciadas em uma plataforma Illumina MiSeq (Illumina Inc., CA, EUA). Uma abordagem metabolômica direcionada baseada em um método validado foi utilizada para analisar as amostras fecais, com um total de 111 metabólitos quantificados. A L-tirosina plasmática foi medida utilizando um cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de fluorescência (HPLC-FLD). Detalhes da extração da amostra e dos métodos de detecção estão descritos nos Métodos ESI.

Análises estatísticas

O tamanho da amostra de 92 pacientes foi calculado para atingir um erro tipo I bilateral de 5% e um poder de 90%, com base em uma diferença média de 1,1 (DP = 1,6) no número de evacuações completas (CBMs) por semana entre o grupo probiótico e o grupo placebo, de acordo com um RCT publicado anteriormente. Assumindo uma taxa de abandono de 20%, planejou-se inscrever um total de 112 pacientes. Todas as análises de dados foram realizadas seguindo os princípios da intenção de tratar. Os dados faltantes foram imputados com o último valor transportado. Os dados quantitativos são apresentados como média ±desvio padrão (DP) e os dados qualitativos são apresentados como frequência (porcentagem). O teste de Wilcoxon pareado foi usado para analisar as diferenças nas características clínicas entre o início do estudo e a semana 12 no grupo probiótico e no grupo placebo. As diferenças nas características clínicas entre os grupos de randomização foram analisadas pelo teste U de Mann-Whitney para dados quantitativos ou pelo teste do qui-quadrado para dados qualitativos. O efeito do tratamento em escala contínua foi analisado utilizando um modelo de regressão linear geral, ajustando-se para potenciais fatores de confusão conforme apropriado. A correlação foi calculada usando a análise de correlação de postos de Spearman. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS (versão 22.0; SPSS Inc., Chicago, IL) e o software R (versão 3.1.0, R Project for Statistical ­Computing). Os valores P para testes múltiplos foram corrigidos pelo método Benjamini-Hochberg para a taxa de falsa descoberta (FDR). Os níveis de significância, incluindo o valor P e o valor FDR-P, foram fixados em 0,05 (bicaudal).