1Yakult Central Institute, 2Benesse Institute for Research on KAIGO (Continuing Care), 3Corporate Planning Department, Yakult Honsha Co., Ltd.
Antes do período pré-intervenção, 13 participantes do grupo intervenção e 12 do grupo não intervenção retiraram seu consentimento ou deixaram suas respectivas instalações. Além disso, 17 participantes do grupo intervenção e 10 do grupo não intervenção retiraram seu consentimento ou faleceram dentro de um mês do período pré-intervenção. Portanto, o conjunto completo de análise incluiu 60 participantes no grupo intervenção e 58 no grupo não intervenção. Os dados sanguíneos foram analisados para 34 e 25 participantes, respectivamente, e quase metade dos participantes não conseguiu realizar os exames de saúde antes e depois da intervenção. O nível basal das necessidades de cuidado do grupo de intervenção foi significativamente menor do que o do grupo sem intervenção. Portanto, o impacto do consumo em longo prazo do LcFM foi explorado por análise de subgrupos, em vez de análise de todos os indivíduos.
Dada a diferença basal entre os grupos no nível de necessidades de cuidado, uma análise de subgrupo foi conduzida com base no nível de necessidades de cuidado para eliminar o impacto dessa diferença. Indivíduos cujos níveis de necessidades de cuidado eram desconhecidos foram excluídos da análise de subgrupos (grupo de intervenção, n = 2; grupo sem intervenção, n = 5). Não houve diferenças significativas para outros parâmetros em cada análise de subgrupo. Quando outra análise de subgrupo foi conduzida com base no IMC – um indicador do estado nutricional –, após a exclusão de indivíduos cujos IMCs eram desconhecidos devido à falta de dados sobre altura (grupo intervenção, n = 4; grupo não intervenção, n = 2), a diferença basal nas necessidades de cuidados permaneceu no subgrupo com IMC mais alto. A taxa mediana de adesão à ingestão de LcFM foi de 100% (IQR, 96%-100%).
Em relação à ingestão alimentar, não houve diferenças significativas entre os grupos em nenhum ponto das análises de subgrupos. Não houve diferenças no peso corporal ou em suas alterações em nenhum momento em nenhuma das análises. No entanto, nas análises de subgrupos baseadas no nível de necessidade de cuidados, o subgrupo com nível de necessidade de cuidados leve a moderado (nível de necessidade de cuidados ≤4) apresentou uma proporção menor de participantes que perderam ≥5% do peso corporal em 12 meses (8,8% vs. 38,1%, p=0,022) no grupo de intervenção. No subgrupo com nível de necessidade de cuidados graves (maior nível de necessidade de cuidados ≥5), não foi detectada diferença significativa entre os grupos. Uma diferença intergrupal na proporção de participantes que perderam ≥5% do peso corporal foi observada no subgrupo com IMC menor (8,6% vs. 31,4%, p=0,037).
Análise da microbiota
A microbiota fecal em cada subgrupo foi avaliada por meio do sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA. Embora as alterações no Lacticaseibacillus e em diversas bactérias menores tenham sido significativas, não houve diferenças significativas nas bactérias predominantes em nível de gênero entre quaisquer pontos. No subgrupo com nível de necessidade de cuidado ≤4, as características observadas aumentaram em 12 meses no grupo de intervenção. Não houve diferenças significativas em outros índices de diversidade α ou contagens bacterianas totais nas análises de subgrupos com base no nível de necessidade de cuidado. No subgrupo com IMC mais baixo, as características observadas e a DP de Faith aumentaram em 12 meses no grupo de intervenção, embora o índice de Shannon tenha aumentado em seis meses no grupo sem intervenção.
Marcadores sanguíneos
Em termos de marcadores sanguíneos para estado nutricional, não houve diferença entre os grupos em nenhum parâmetro. Outra análise baseada na perda de peso foi então realizada após a coleta de dados de todos os participantes para examinar a influência da perda de peso ≥5% nos parâmetros sanguíneos. Os participantes que perderam ≥5% do peso corporal apresentaram maior redução nos níveis de albumina e hemoglobina do que aqueles que não perderam. Além disso, análises de subgrupos baseadas no nível de necessidade de cuidados e no IMC mostraram que essas diferenças foram detectadas apenas nos subgrupos com menor nível de necessidade de cuidados e menor IMC.
Análise de amostra fecal
Uma porção de fezes (0,5g) foi coletada para a medição da contagem bacteriana total em tubo contendo 2ml de RNAlater (Ambion, Austin, TX, EUA) para análise da microbiota. Amostras fecais foram coletadas imediatamente após a defecação. Para a medição da contagem bacteriana total, após a adição de solução salina tamponada com fosfato (PBS)(-) para preparar uma diluição fecal de 10 vezes, 300 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% foram adicionados a 100 μL de homogeneizado fecal. A amostra foi incubada a 4°C por 16 horas. Em seguida, foi mantida a -30°C até o uso. As amostras fecais fixadas com PFA foram diluídas 80 vezes com adição de um volume equivalente de PBS e foram filtradas através de uma malha de náilon nº 200 (AS ONE, Tóquio, Japão) para remover partículas maiores. As suspensões fecais foram diluídas 400, 2.000 e 10.000 vezes com PBS. Posteriormente, cada diluição fecal foi misturada em uma placa de 96 poços, com diluição de 10 μL, 10 μL de Precision Count Beads (BioLegend, San Diego, CA, EUA, 1,03 × 106 partículas/ml) para padronização interna, 30 μL de PBS e 150 μL de PBS contendo SYTO BC diluído 3.000 vezes (Invitrogen, Leek, Holanda). As misturas foram incubadas em gelo por 15 a 60 minutos e aplicadas a um citômetro de fluxo CytoFLEX S (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA).
Os dados de FCS foram obtidos e analisados usando o CytoExpert v2.4 (Beckman Coulter). A contagem bacteriana total nas fezes por 1g foi determinada pela razão entre o número de bactérias SYTO BC-positivas e as contagens de esferas do padrão interno. Para extração de DNA, amostras fecais foram pesadas e suspensas em nove volumes de RNAlater para preparar um homogeneizado fecal (100mg de fezes/ml). Após a adição de 1ml de PBS a 200 μL, o homogeneizado fecal foi centrifugado a 13.000 × g por 10 minutos e 1ml do sobrenadante foi descartado. Após outra lavagem com 1ml de PBS, os pellets foram armazenados a -30°C até o uso para extração de DNA. O DNA foi extraído conforme descrito anteriormente. O PCR foi realizado em um sistema de PCR em tempo real ABI 7500 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EUA). A solução para reação em cadeia da polimerase (PCR) (50 μL) continha 25 μL de 2 × TB Green Premix Ex Taq (Tli RnaseH plus; Takara Bio Inc., Shiga, Japão), 22 μL de água livre de nucleases, 1 μL de primers 100 nM cada e 1 μL de DNA molde. As condições de PCR foram 95°C por 30 segundos, seguidas por 40 ciclos de 95°C por cinco segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 40 segundos. O PCR foi monitorado pelo sinal SYBR e interrompido antes da saturação do sinal.
Os produtos do PCR foram purificados usando kit AMPure XP (Beckman Coulter) e quantificados com kit Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen). A biblioteca foi construída misturando quantidades iguais de DNA para cada amostra e sequenciada em um Sistema MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA) usando ciclo de 2 × 250-pb de extremidade pareada e Kit de Reagentes MiSeq v2 (Illumina). As leituras da sequência do amplicon foram processadas por meio do QIIME 2. Os dados brutos de sequenciamento do amplicon foram processados em uma tabela de variantes exatas da sequência do amplicon (ASVs) presentes em cada amostra usando o plugin DADA2. A diversidade α das amostras foi analisada em uma profundidade de amostragem de 5.000. A diversidade de Shannon, as características observadas e os índices de diversidade filogenética de Faith (PD de Faith) foram calculados pelo QIIME 2 usando o plugin de diversidade para analisar a diversidade α.
Desfechos
O peso corporal e os indicadores nutricionais no sangue (proteína total, albumina, colesterol total e hemoglobina) foram avaliados. Para a avaliação do peso corporal, as mudanças no peso corporal da linha de base até 6 e 12 meses foram comparadas entre os grupos. Como a perda de peso de mais de 5% é um dos critérios diagnósticos para desnutrição, a proporção de participantes que perderam ≥5% do peso corporal da linha de base em cada ponto no tempo foi comparada entre os grupos. Também foram realizadas análises de subgrupos com base nos níveis de necessidades de cuidados e IMC para ajustar as diferenças intergrupais nas características da linha de base e identificar a população com maior probabilidade de se beneficiar da intervenção. O nível de necessidade de cuidados foi categorizado como ≤4 (nível de cuidados de longo prazo ≤2, leve) e ≥5 (nível de cuidados de longo prazo ≥3, moderado-grave) de acordo com o sistema LTCI no Japão. O IMC foi categorizado como <22 e ≥22 kg/m2 com base nos critérios GLIM. Os valores do ponto de tempo anterior foram utilizados para imputação de valores ausentes em cada ponto de tempo. Os dados dos participantes que abandonaram o estudo antes de cada ponto foram excluídos da análise. Para a avaliação dos marcadores sanguíneos foram comparados os valores medidos no início e após a intervenção de 12 meses, bem como as alterações em relação ao início. Além disso, para explorar o impacto da perda de peso nos marcadores, os participantes de ambos os grupos foram agrupados e as diferenças em cada medida foram comparadas entre aqueles que haviam perdido ≥5% do peso corporal e aqueles que não haviam perdido.
