Para elucidar o mecanismo dos efeitos benéficos dos probióticos in vivo são necessários métodos eficientes para aumentar cepas probióticas dentre as bactérias comensais. Então, foi desenvolvida uma abordagem baseada em IMS que utiliza anticorpo L8 específico para LcS e esferas magnéticas para o isolamento desse probiótico. Utilizando dessa abordagem, foi examinada a recuperação de LcS de amostras fecais de seis participantes que ingeriram um produto láteo comercialmente disponível que contém LcS. Anteriormente, Lim e colaboradores (2016) estabeleceram o método de IMS para o isolamento de E. coli O157:H7 e examinaram a sua recuperação como bactéria-alvo de um produto de leite pasteurizado enriquecido com a bactéria de 102 a 106 UFC/ml. A taxa de recuperação foi maior que 90% em amostras enriquecidas com menos de 104 UFC/ml, mas menor que de 80% em enriquecimento de 106 UFC/ml. Utilizando a abordagem de IMS foi possível coletar mais de 70%-90% de LcS das amostras fecais contendo 106 a 107 UFC/ml de LcS, indicando que o método pode capturar bactérias-alvo com mais eficiência se comparado ao método anterior de Lim e colaboradores.
No estudo atual, a taxa de recuperação diminuiu gradualmente à medida que a quantidade de amostras fecais aumentou (95,5% de 0,01g de fezes, enquanto 72,1% de 0,1g de fezes). Especula-se que as células de LcS possam agregar nas esferas conforme o volume de fezes da amostra aumenta, o que causaria a baixa taxa de recuperação. Constatou-se que a taxa de LcS residual em 0,01g e 0,1g de amostras fecais após o IMS foi quase a mesma (aproximadamente 2%-4%) – dado não apresentado – sugerindo que mais de 90% do LcS foi de fato coletado em frações esféricas em ambos os casos. Esta hipótese deve ser verificada em estudos futuros. Além disso, os dados do sequenciamento do 16S rRNA mostraram que a família Lactobacillaceae, dos quais a maioria era LcS (dados não demonstrados), representou mais de 70% do total de bactérias ligadas às esferas magnéticas após o tratamento por IMS. Concomitantemente, esses resultados indicam que a abordagem não é só eficiente, mas também específica para o LcS em níveis aceitáveis.
Na IMS, vários fatores – como o anticorpo específico para o organismo-alvo, a força da ligação do anticorpo às esferas magnéticas e o formato e tamanho das esferas magnéticas – pode afetar a habilidade de resgatar as bactérias. Na IMS usada para o isolamento do patógeno E. coli, o antígeno O, que é um componente da bactéria, e o antígeno K, derivado da membrana capsular, são frequentemente utilizados como alvo do anticorpo vinculado às esferas magnéticas. Voitoux e colaboradores relataram que o estresse ambiental pode afetar a reatividade entre antígeno-anticorpo, sugerindo que certos epítopos podem não ser expressos universalmente ou podem ser alterados estruturalmente na superfície da E. coli patogênica. O anticorpo L8 utilizado se liga ao polissacarídeo da parede celular do LcS. A estrutura da parede celular onde o polissacarídeo adere na superfície da bactéria ácido lática difere mesmo dentro da mesma espécie bacteriana, pois os açúcares constituintes e sua ligação, sua ramificação e a substituição variam entre si. Além disso, o anticorpo L8 é relatado como reativo apenas ao LcS, e não reativo a outras cepas de L. casei, espécies de lactobacilos e bactérias intestinais representativas. Portanto, a especificidade desse anticorpo para LcS foi considerada alta.
Alto nível de recuperação do LcS
Neste estudo foi utilizado o sistema biotina-estreptavidina para ligar as esferas magnéticas ao anticorpo. Esta ligação é a mais forte de todas as interações não covalentes conhecidas entre proteína e ligantes. Além disso, as esferas magnéticas utilizadas (Dynabeads MyOne Streptavidin T1) têm um tamanho mais uniforme de partículas do que as esferas de outros fabricantes. Assim, permite uma excelente reprodutibilidade. Também possuem uma partícula de tamanho menor (1 µm), comparada a outros produtos comercializados como o Dynabeads anti-E. coli O157 da Thermo Fisher (2,8 µm diâmetro). Portanto, foi considerado que o alto nível de recuperação do LcS das fezes foi resultado da combinação da alta especificidade do anticorpo e a forte ligação entre o anticorpo e as esferas magnéticas.
No participante F, Lachnospiraceae foi a família bacteriana dominante recuperada com as esferas magnéticas. Este grupo de bactéria representou 27,6% dos organismos nas fezes originais e 41,1% dos organismos recuperados por IMS, indicando que o tratamento de IMS enriqueceu o grupo Lachnospiraceae em aproximadamente 1,5 vezes para esta amostra. Embora a Lachnospiraceae estivesse presente em alta, a hipótese é que a composição das espécies e cepas de Lachnospiraceae difere entre os participantes, e apenas as cepas presentes nas fezes do participante F apresentaram fraca reação cruzada com o anticorpo L8. A hipótese é que o processo de lavagem na etapa 5 tenha sido insuficiente, causando a contaminação de outras bactérias que apresentam reação cruzada fraca com o anticorpo L8.
A limitação da IMS está no padrão de expressão de gene, que pode ser alterado durante o processo de tratamento. Geralmente, leva pelo menos 3h para isolar o LcS por IMS. Embora a amostra seja mantida no gelo ou em ambiente frio neste processo, isso pode afetar os resultados de experimentos subsequentes – como o sequenciamento de RNA –, devido à degradação. Uma estratégia para prevenção de alteração da expressão genética do LcS no tratamento é a fixação do RNA antes da IMS (i. e. adição de reagente de retardação de RNA). Futuros estudos são necessários para verificar este tratamento em combinação com IMS.
