O LcS foi cultivado no meio MRT a 37°C por 16 horas, sem agitação. As células foram colhidas por centrifugação e lavadas repetidamente com solução salina tamponada com fosfato (-) até o pH do tampão ser 6,0. Foi obtido um rendimento de ~1,5 g de pellet celular úmido/L de cultura. As células foram ressuspensas em solução salina fisiológica e liofilizada, obtendo 9.4 g de células secas. As células liofilizadas (9.4 g) foram ressuspensas em 300 mL de água e aquecidas em autoclave a 121°C por 30 min. Após resfriamento, a suspensão foi centrifugada (19,650×g, 30 min) e o sobrenadante foi coletado. O sedimento celular foi lavado três vezes com água. O sobrenadante e as lavagens foram combinados e concentrados até ~100 mL por um evaporador (Rotavapor R-210; Buchi, Flawil, Suíça) e etanol foi adicionado a uma concentração de 70% para formar um precipitado.
O precipitado foi dissolvido em água e dialisado contra água usando uma membrana de diálise (Spectra/Por 1, MWCO 6000-8000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) a 5°C e liofilizado para obter polissacarídeos brutos (o rendimento foi de ~820 mg). Os polissacarídeos brutos foram dissolvidos em um pequeno volume de solução de NH4HCO3 50 mM, e a solução foi submetida à filtração em gel em uma coluna Sephacryl S-300 HR (2,6 x 60 cm; Cytiva, Marlborough. MA, EUA) a uma vazão de 0,3 mL/min. Os açúcares neutros em cada fração foram quantificados pelo método do ácido fenol sulfúrico, e as frações dos picos foram combinadas. As frações foram concentradas utilizando um evaporador, dessalinizadas com um acilizador e liofilizadas para obter 108 mg de LCPS-1 purificado. PS-PG1 foi preparado usando N-acetilmuramidaze SG conforme descrito anteriormente.
Degradação controlada do ferreiro do LCPS-1
O LCPS-1 foi submetido à degradação de Smith usando os métodos padrão descritos anteriormente. Primeiro, 20 mg de LCPS-1 foram dissolvidos em 600 μL de água. Em seguida, foi adicionado sequencialmente 1 mL de solução aquosa de 0,2 M NaIO4, 200 μL de 0,5 tampão de acetato de sódio M (pH 5,0) e 200 μL de água em agitação contínua. A solução foi protegida da luz com papel alumínio e agitada a 5°C por 20 horas para clivar os dióis vicinais. Após adicionar 10 μL de etilenoglicol à solução e agitar a 5°C por 4h, foi adicionado 1 mL de solução de borato de sódio 0,2 M (pH 8,0). Em seguida, 1 mL de solução aquosa de NaBH4 1M foi adicionado gota a gota e a reação redutora foi mantida a 5°C por 20 horas. A reação foi interrompida pela adição de ácido acético e a solução reacional foi dialisada contra água usando uma membrana Spectra/Por 1 (Thermo Fisher Scientific) a 5°C e liofilizada. O produto da reação foi dissolvido em 1 mL de solução aquosa de HCl 0,5 M e reagiu a 25°C por 16 horas para induzir degradação controlada e obter oligossacarídeos. A solução reacional foi neutralizada com NaOH 0,6 M e centrifugada a 10.000xg por 10 min para obtenção do sobrenadante. O sobrenadante foi diluído com uma pequena quantidade de água e fracionado usando uma coluna Sephadex G-25 (26 × 600mm; Cytiva) com água a uma vazão de 0,6 mL/min. Os açúcares neutros em cada fração foram quantificados pelo método fenol-ácido sulfúrico.
Desaminação de LCPS-1
Resumidamente, 20 mg de LCPS-1 foram desacetilados com 120 mg de tiofenol de sódio e 4 mL de metilsulfinilmetaneto de potássio 2,5 M a 100°C por 15 h. A solução de reação foi dialisada contra água a 5°C usando uma membrana de diálise (Spectra/Por 1, MWCO 6000-8000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e depois liofilizada para obter LCPS-1 N-desacetilado. Ao LCPS-1 N-desacetilado foram adicionados 1 mL de KHSO4 a 5% e NaNO2 a 5% de cada para realizar a desaminação, e a mistura reacional foi mantida a 25°C por 16h. A reação foi encerrada adicionando 1,0 mL de solução aquosa de sulfamato de amônio a 12,5%, e a solução reacional foi seca e concentrada usando um evaporador centrífugo (VC-36; TAITEC, Koshigaya, Saitama, Japão). Ao resíduo foi adicionado 1,0 mL de solução aquosa de NaBH4 1 M e a redução foi realizada a 5°C por 20h. Em seguida, foi adicionado ácido acético e a mistura foi dessalinizada, seca e concentrada utilizando um evaporador centrífugo. Os produtos foram fracionados em coluna Bio-gel P2 (16 × 600 mm; BioRad, Hercules, CA, EUA), com água a uma vazão de 0,3 mL/min. O açúcar neutro em cada fração foi analisado pelo método fenol-ácido sulfúrico.
O-desacetilação do LCPS-1
LCPS-1 (20 mg) foi tratado com 0,5 mL de hidrazina anidra (reagente Cosmo Bio Hydrazinolítico Y) a 100°C por 8h. A solução reacional foi diluída com água, neutralizada com ácido sulfúrico concentrado, concentrada e dialisada contra água a 5°C usando uma membrana Spectra/Por 1 (Thermo Fisher Scientific). A solução dialisada foi liofilizada e rendeu ~18,8 mg de produto des-O-acetilado.
